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Methodenspektrum

Auszug etablierter Methoden der AG Höhfeld

Ueberschrift

 

Filter Trap

Bei der Filter-Trap-Analyse können Proteine mit Hilfe eines Vakuum-Blot-Verfahrens detektiert werden. Hierbei wird Protein-Lysat mit Hilfe einer Dot-Blot-Apparatur durch eine Membran gesaugt. Detergenz-unlösliche Bestandteile werden dabei auf die Membran gespottet, während die lösliche Fraktion die Membran passiert. Mittels eines spezifischen Antikörpers können die gespotteten Proteine detektiert werden. Diese Methode eignet sich insbesondere für den Nachweis von aggregierenden Proteinen.

filter trap

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Makroarrays

Um neue Proteininteraktionen zu finden, verwenden wir ein Hochdurchsatzscreening. Dabei werden auf einer Filtermembran Proteine einer cDNA-Bank gespottet (Bait). Das zu untersuchende fluoreszensgekoppelte Protein (Prey) wir auf die Membran gegeben und der Array mittels Li-Cor Odyssey Scanner ausgelesen und mit einer speziellen Software ausgewertet. Spezifische Interaktoren können so nachgewiesen werden.

screen

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Licor Infrared-Imaging System

Der Licor Odyssey ist ein Infrarot-Scanner, der seine Anwendung hauptsächlich bei Western-Blots findet. Hierbei werden statt der Peroxidase-gekoppelten Antikörper Fluorophore verwendet, die im Infrarot-Spektrum emittieren. Der Vorteil gegenüber der Chemilumineszenz liegt in der zuverlässigeren Quantifizierung, einfachen Handhabung, zwei unabhängige Detektionskanälen und dem weiten Anwendungsspektrum. So ist es ebenfalls möglich Coomassie-, DNA-Gele, Macroarrays und selbst kleine Tiere zu scannen

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In-vitro Ubiquitinierung

Fehlerhaft gefaltete oder entfaltete Proteine werden über das Proteasom abgebaut. Dafür werden sie mit Polyubiquitinketten für den Abbau markiert. Die Ubiquitinierung von Substratproteinen erfolgt durch das Zusammenwirken von Ubiquitin-aktivierenden Enzymen (E1), Ubiquitin-konjugierenden Enzymen (E2) und den Ubiquitin-Ligasen (E3). Mit Hilfe von aufgereinigten Proteinen des Ubiquitinierungssystems kann die Polyubiquitinerung von potentiellen Substraten in-vitro nachgestellt werden. Hierbei ist es auch möglich den Einfluss anderer Proteine auf die Ubiquitinierung zu untersuchen.

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